线栓法MCAO造模实验解决方案
日期：2013-03-26 20:46:31点击：0
大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion，MCAO) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型，MCAO 模型先阻断颈外动脉（ECA）及其分支，且阻断翼腭动脉（PPA），以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA 插入尼龙线，经颈内动脉（ICA）到大脑前动脉（ACA），机械性阻断大脑中动脉（MCA） 发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线，恢复血流，实现再灌注。 线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点，用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性，药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想，同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点，适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素，可避免实验结果的不稳定性。
1、主要器材
（1）缺血前准备：脑立体定位仪、（小鼠适配器）、微量注射泵、微量注射器、颅钻
（2）缺血模型制作：气体麻醉机、异氟烷、体视显微镜、冷光源、手术台、术后保温箱、脑模具、手术器械包
（3）缺血模型评价：神经功能评价法（BBB评分）、TTC染色、病理学评价
（4）缺血后行为检测：抓力测试仪、转棒仪......
2、实验动物
（1）SPF级Wistar大鼠，健康，雄性，体重为250-300g。
（2）SPF级C57小鼠，健康，雄性，体重为18 - 25g，实验Protocol和视频，请点击观看和下载: Click Here
3、实验分组
实验分六组：正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组，每组15只动物。
4、建模方法（以大鼠为例）
（1）1.5-2%异氟烷气体麻醉大鼠，颈部备皮，消毒，插入肛温探头，保持体温在37±0.5℃。
（2）颈部正中切口，暴露右侧颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm处结扎颈外动脉远心端，在颈外动脉穿入另一根6-0丝线，在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。
（3）使用动脉夹夹闭颈总动脉。在距离颈总动脉分叉处3mm处的颈外动脉上剪一个小口，将一根头端处理过的0.33mm直径的尼龙线从小口中插入，进入颈内动脉，并向内插入大脑中动脉，尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约16±1mm。
（4）缺血后90min拔掉线栓，用6-0丝线结扎外动脉近心端，用3-0丝线缝合颈部伤口，活力碘消毒伤口，将大鼠放在加热垫上，待清醒后放入恒温抚养箱饲养。
（5）术后24h，对小鼠进行神经功能评分，然后继续麻醉大鼠，取大脑切片、进行TTC染色和病理染色。
5、模型的评价
（1）神经功能缺失体征评分
参考 Longa 及Bederson 的5 分制法在动物麻醉清醒后24h 进行评分，分值越高,说明动物行为障碍越严重。
0 分：无神经损伤症状
1分：不能完全伸展对侧前爪
2分：向对侧转圈
3分：向对侧倾倒
4分：不能自发行走,意识丧失
（2）TTC染色
麻醉大鼠后 ，取大鼠脑组织 ，放入 -20 ℃冰箱冷冻 30min 30min。用 PBS配置 1% TT C（W/V ），37 ℃水浴至 TTC 溶解， 将冻好的脑组织切片 ，置于 10ml TTC 溶液 中， 37 ℃恒温孵育 10min。不时翻动脑片，使 组织均匀染色。正常脑染色后呈鲜红，而梗死区呈苍白。
附：小鼠缺血2h后TTC染色效果图，如下：
（3）病理学评价
取脑后用 4% 多聚甲醛溶液 固定，蔗糖溶液脱水后经 固定，蔗糖溶液脱水后经 固定，蔗糖溶液脱水后经 OCT 包埋做冰冻切片 ，包埋做冰冻切片 ，10um ， 做尼氏染色， 做尼氏染色可做梗死面积的评价。
