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线栓法MCAO造模实验解决方案

日期:2013-03-26 20:46:31点击:1325
大脑中动脉阻塞 (middle cerebral artery occlusion,MCAO) 是目前最常用的局灶性脑缺血模型,MCAO 模型先阻断颈外动脉(ECA)及其分支,且阻断翼腭动脉(PPA),以切断颅外来源的侧副循环血流。从ECA 插入尼龙线,经颈内动脉(ICA)到大脑前动脉(ACA),机械性阻断大脑中动脉(MCA) 发出处的血供来建立大脑中动脉缺血模型。此模型可在无麻醉状态下拔出尼龙线,恢复血流,实现再灌注。 线栓法具有不开颅、效果肯定、可准确控制缺血及再灌注时间的优点,用于研究神经元对缺血的敏感性、耐受性,药物疗效观察以及再灌注损害和治疗时间窗较为理想,同时也具有对全身影响小、动物存活时间长的特点,适于慢性脑损伤的研究。控制好易变因素,可避免实验结果的不稳定性。
1、主要器材
(1)缺血前准备:脑立体定位仪、(小鼠适配器)、微量注射泵、微量注射器、颅钻
(2)缺血模型制作:气体麻醉机、异氟烷、体视显微镜、冷光源、手术台、术后保温箱、脑模具、手术器械包
(3)缺血模型评价:神经功能评价法(BBB评分)、TTC染色、病理学评价
(4)缺血后行为检测:抓力测试仪、转棒仪......
2、实验动物
(1)SPF级Wistar大鼠,健康,雄性,体重为250-300g。
(2)SPF级C57小鼠,健康,雄性,体重为18 - 25g,
实验Protocol和视频,请点击观看和下载: Click Here
3、实验分组
实验分六组:正常对照组、模型组、阳性药组、受试药组三个剂量组,每组15只动物。
4、建模方法(以大鼠为例)
(1)1.5-2%异氟烷气体麻醉大鼠,颈部备皮,消毒,插入肛温探头,保持体温在37±0.5℃。
(2)颈部正中切口,暴露右侧颈总动脉,颈内动脉和颈外动脉。使用6-0丝线在距离颈总动脉分叉4mm处结扎颈外动脉远心端,在颈外动脉穿入另一根6-0丝线,在靠近颈总动脉分叉处打一个活结。
(3)使用动脉夹夹闭颈总动脉。在距离颈总动脉分叉处3mm处的颈外动脉上剪一个小口,将一根头端处理过的0.33mm直径的尼龙线从小口中插入,进入颈内动脉,并向内插入大脑中动脉,尼龙线的插入深度距离颈总动脉分叉处约16±1mm。
(4)缺血后90min拔掉线栓,用6-0丝线结扎外动脉近心端,用3-0丝线缝合颈部伤口,活力碘消毒伤口,将大鼠放在加热垫上,待清醒后放入恒温抚养箱饲养。
(5)术后24h,对小鼠进行神经功能评分,然后继续麻醉大鼠,取大脑切片、进行TTC染色和病理染色。
5、模型的评价
(1)神经功能缺失体征评分
参考 Longa 及Bederson 的5 分制法在动物麻醉清醒后24h 进行评分,分值越高,说明动物行为障碍越严重。
0 分:无神经损伤症状
1分:不能完全伸展对侧前爪
2分:向对侧转圈
3分:向对侧倾倒
4分:不能自发行走,意识丧失
(2)TTC染色
麻醉大鼠后 ,取大鼠脑组织 ,放入 -20 ℃冰箱冷冻 30min 30min。用 PBS配置 1% TT C(W/V ),37 ℃水浴至 TTC 溶解, 将冻好的脑组织切片 ,置于 10ml TTC 溶液 中, 37 ℃恒温孵育 10min。不时翻动脑片,使 组织均匀染色。正常脑染色后呈鲜红,而梗死区呈苍白。
附:小鼠缺血2h后TTC染色效果图,如下:

(3)病理学评价
取脑后用 4% 多聚甲醛溶液 固定,蔗糖溶液脱水后经 固定,蔗糖溶液脱水后经 固定,蔗糖溶液脱水后经 OCT 包埋做冰冻切片 ,包埋做冰冻切片 ,10um , 做尼氏染色, 做尼氏染色可做梗死面积的评价。
 
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